Neďaleko Chrámu Sv. Trojice stojí budova jedného z najvýznamnejších školských ústavov a rozhodne najvýznamnejšia pamiatka na protestantské školstvo v našich kultúrnych dejinách. O založení prešovského evanjelického Kolégia rozhodli delegáti hornouhorských protestantských stavov na zasadnutí v Košiciach 18. novembra 1665. Zamýšľali zriadiť vyššiu evanjelickú školu, ktorá mala byť dôstojnou protiváhou jezuitskej univerzity v Trnave. V nasledujúcom roku bol položený jej základný kameň a o ďalší rok na jeseň sa začala výučba v novej škole. Nemalými finančnými prostriedkami prispeli na stavbu nielen hornouhorskí protestantskí magnáti, zemania či slobodné kráľovské mestá, ale takisto švédsky kráľ, sedmohradské stavy a niektoré nemecké kniežatá. Kolégium nadviazalo na bohaté tradície mestskej humanistickej školy, kde popri viacerých významných osobnostiach krátky čas pôsobil i J. A. Komenský.
Podľa vzoru podobných evanjelických škôl v Nemecku bolo zriadené desaťtriedne gymnázium s kurzom teológie a filozofie v najvyšších ročníkoch. Od začiatku na ňom vyučovali viacerí významní profesori z celého Uhorska i zo zahraničia, ako Dr. Samuei Pomarius, filozof a pedagóg Eliáš Ladiver, spisovateľ a historik Ján Rezik či Samuei Mathaeides. Medzi jeho prvými študentmi môžeme nájsť niektoré neskoršie významné osobnosti (vodca protihabsburského odboja Imrich Thököly, slávny anglický barokový maliar Jakub Bogdani a i.). Vďaka jej osobnostiam, ako aj moderným učebným metódam dosiahla škola zakrátko takú úroveň, že stavy plánovali jej premenu na evanjelickú univerzitu.
Náhlym zvratom politického vývinu v krajine po Vesselényiho sprisahaní došlo však r. 1671 k násilnému prerušeniu tohto sľubného vývinu. Budovu obsadilo vojsko, o dva roky nato (1673) ju dostali jezuiti a zriadili si v nej svoju rezidenciu. Evanjelické kolégium bolo zrušené a profesori museli opustiť mesto. Tento stav trval do roku 1682, keď Imrich Thököly ako jeho bývalý žiak obnovil činnosť Kolégia a zo sedmohradského exilu povolal za rektora Eliáša Ladivera. Po porážke odboja sa doňho opäť nasťahovali jezuiti. Posledné obdobie rozkvetu prežívalo staré Kolégium počas povstania Františka II. Rákócziho, za rektorátu J. Rezika. Jeho absolventi mohli ďalej bezplatne pokračovať v štúdiu na švédskej univerzite v Greifswalde a ružomberská synoda opäť rozhodla o jeho transformovaní na neúplnú evanjelickú univerzitu, jedinú v Uhorsku.
Po obsadení Prešova cisárskym vojskom v decembri 1710 kapitulačné podmienky garantovali síce zachovanie kolégia, avšak kráľovná Eleonóra v nasledujúcom roku prikázala evanjelikom odísť a odovzdať budovu opäť jezuitom. Na protest proti tomuto rozhodnutiu študenti odniesli, resp. zničili väčšinu zariadenia, vrátane pôjdov, strechy a podlahy, čím spôsobili také škody, že oprava trvala jezuitom takmer dva roky. Počas ďalších šesťdesiatich rokov slúžila kolegiálna budova ako jezuitská rezidencia, až do zrušenia rádu r. 1773, keď sa spolu so susedným kostolom Svätej Trojice stala majetkom eráru.
Evanjelici si po vykázaní z mesta smeli v zmysle platných zákonov postaviť iba drevenú triviálnu školu na predmestí. Pre odpor magistrátu a jezuitov sa im to podarilo až r. 1715. V polovici storočia nahradili túto budovu modernejšou, v ktorej, napriek zákazu, vyučovali i tzv. vyššie náuky, filozofiu, históriu a teológiu. Najvýraznejšími vedeckými osobnosťami školy tohto obdobia boli historik Ján Samuei Klein a Gregor Fábri. V roku 1770 navštívil predmestskú školu cisár a kráľ Jozef II. a s jeho pomocou o trinásť rokov neskôr za 6000 zlatých kúpili evanjelici v dražbe budovu Kolégia spolu s bývalým maďarským kostolom (t.j. Chrámom Svätej Trojice).
Od roku 1785 prebiehala výučba v pôvodnej budove Kolégia. Škola bola pôvodne gymnáziom, ktoré podľa svojich možností spoločne spravovali oba prešovské evanjelické zbory. Dôležitým medzníkom vo vývine kolégia bol rok 1804, keď získalo status dištriktuálneho kolégia, s pôsobnosťou pre územie celého Potiského dištriktu evanjelickej a. v. cirkvi. Významne sa do jeho dejín zapísal takisto rok 1815, keď sa na ňom začalo prednášať právo. Pri celokrajinskom hodnotení evanjelických stredných škôl v tomto období sa Kolégium umiestnilo na druhom mieste, hneď za bratislavským lýceom. V prvej polovici 19. storočia vyrástlo na jednu z najvýznamnejších vyšších škôl v celom Uhorsku, s kurzom práva a teológie vo vyšších ročníkoch. Navštevovali ho študenti z viacerých, neraz i vzdialenejších stolíc (Báčskej, Torontálskej, Békešskej a i.). Viacerí z nich sa neskôr preslávili v politickom, kultúrnom či vedeckom živote, ako M. M. Hodža, J. Záborský, L. Kossuth, básnik F. Kerényi, estét A. Greguš, generál revolúcie 1848/49 Aristid Desewffy, historik Ľ Haán, politik a archeológ F. Pulsky a iní. Z významnejších profesorov pôsobili v tomto období filozof a estét Michal Greguš a neskorší profesor univerzity v Cambridge Samuei Marek Schiller – Szinessy.
V tomto období pôsobili na Kolégiu študentské literárne spoločnosti, ktoré sa stali významnými strediskami hlavne slovenského a maďarského národného života v meste. Vďaka vysokej úrovni kolégia vznikli na prahu revolúcie r.1848/49 opäť projekty na jeho prebudovanie na univerzitu. Počas revolúcie bojovalo viacero profesorov aj študentov v armáde a v záverečnej fáze vojny slúžila budova vojsku ako sklad, kasárne a nemocnica.
V období Bachovho absolutizmu utrpelo Kolégium veľké škody snahou vlády o unifikáciu školského systému na území monarchie a likvidáciu autonómneho protestantského školstva. Okrem toho v dôsledku zrušenia uhorských peňazí bez náhrady a emigrácie jeho podporovateľov (za účasť v revolúcii) prišlo o svoj majetok a hlavný zdroj príjmov. Musel byť preto zrušený kurz práva i teológie a s problémami zápasilo aj kolegiálne gymnázium, udržiavané iba s pomocou darov zo zahraničia.
Po páde absolutizmu a po rakúsko-maďarskom vyrovnaní (1867) nastal v 70. rokoch dynamický rozvoj školy. Kolégium sa stalo mohutným školským ústavom, združujúcim plnotriedne gymnázium, právnickú a teologickú akadémiu a učiteľský ústav. Okrem nich mu patrila aj veľká historická knižnica, zbierky školského múzea (prírodovedné a numizmatické) a internát. Z radov profesorov sa vo vede najviac preslávili filozof akademik Andrej Vandrák, prírodovedec akademik Fridrich Hažlinský, cirkevní historici Jozef Hörk a Ján Gömöry, právnik Dr. Šimon Horovitz a iní. Spomedzi slovenských študentov, činných v literárnom a národnom živote, treba spomenúť aspoň vedúce osobnosti spolku Kolo, P. O. Hviezdoslava a K. Banšella. Žiaľ, na sklonku storočia sa Kolégium stávalo centrom maďarizácie a jeho vedenie neraz prenasledovalo študentov za ich národné cítenie. Pred prvou sve