Na mieste dnešného kostola stál pôvodne menší kostol, ktorý prešovskí mešťania dali postaviť ešte v 15. st., a to neďaleko už jestvujúceho Kostola sv. Mikuláša. Pravdepodobne slúžil maďarskému obyvateľstvu. Zasvätený bol sv. Ladislavovi (1077-1095), niekdajšiemu uhorskému panovníkovi, ktorý bol po smrti vyhlásený za svätého. Tento stredoveký kostol z nám neznámych príčin zanikol.
Na začiatku 30. rokov 16. st. Prešovčania pomerne rýchlo prijali Lutherovo učenie. Veľkú zásluhu na tom mali prešovskí Nemci, ktorí mali s nemeckými krajinami dobré a čulé kontakty. V roku 1531 prešovskí katolícki kňazi Anton Transylvanius a Bartolomej Bogner sa spolu s veriacimi prihlásili k reformácii, čo spôsobilo, že sa Prešov zakrátko stal mestom s protestantským vierovyznaním. Takým pretrval až do roku 1671, ba dovtedy v meste ani iná cirkev nepôsobila.
Prešovská evanjelická cirkev sa organizovala na národnostnom princípe, takže v meste pôsobili traja kňazi – slovenský, nemecký a maďarský. Podľa toho si rozdelili aj kostoly. Nemeckým evanjelikom pripadol Kostol sv. Mikuláša, slovenským dnešný kostol sv. Jána Krstiteľa a maďarskí evanjelici si v r. 1565 postavili vlastný kostolík južne od Slovenskej ulice v štvrti nazvanej Quintum quartale. O 77 rokov neskôr už maďarským evanjelikom postavený kostolík nepostačoval. Magistrát mesta súhlasil s výstavbou nového kostola, a to na námestí na mieste pôvodného Kostola sv. Ladislava. Stavba mala veľkú podporu u richtára Daniela Lengfelnera (richtárom bol v rokoch 1642-1648 a 1653-1656) a cirkevných dozorcov Adama Zimmermanna a Daniela Schneidera.
25. júla 1642 bol položený základný kameň, o 5 rokov neskôr bola stavba dokončená a 16. júna 1647 slávnostne posvätená. Stavba kostola, posvätenie základného kameňa i posvätenie chrámu prezrádzajú, že v Prešove v tom období prevládali tolerantné národnostné vzťahy. Český exulant a zároveň slovenský kňaz Jakub Jakobeus (1591-1645) mal pri posvätení základného kameňa stavby chrámu (1642) slávnostnú kázeň Věčná a neumírajúcí paměť založení chrámu Božího národa Uherského ve svobodném královském městě Prešove.
Prešovskej evanjelickej cirkvi, pre ktorú bol kostol postavený, slúžil do r. 1670. Po potlačení Veselényiho sprisahania a po obsadení Prešova habsburským vojskom generála Spankaua bol v r. 1671 Chrám Sv. Trojice, tak ako aj ostatné kostoly, evanjelikom odňatý a pridelený v meste sa obnovujúcej katolíckej cirkvi. Do užívania ho dostali jezuiti. V roku 1672, keď do mesta prišli kurucké vojská, sa kostol nakrátko vrátil evanjelikom, ale už koncom toho istého roku bol opäť v rukách jezuitov. Jezuiti otvorili v blízkej budove bývalej Mestskej školy (dnes budova Knižnice P.O.Hviezdoslava) jezuitské gymnázium a usadili sa v budove Kolégia, ktorá im tiež pripadla.
O desať rokov neskôr (1682) sa počas povstania Imricha Thökölyho Chrám Sv. Trojice vrátil do rúk evanjelikov, ktorí ho používali do r. 1686. Potom bol opäť spravovaný jezuitmi. Počas povstania Ferenca Rákocziho II (1705-1711), keď bol Prešov obsadený jeho vojskom, bol kostol vrátený evanjelikom. V novembri 1710 však mesto, zdecimované strašnou morovou epidémiou, kapitulovalo pred silnejším habsburským vojskom a v nasledujúcom roku už kráľovná Eleonóra Magdaléna vydala nariadenie (25.7.1711), podľa ktorého mali prešovskí evanjelici opustiť Chrám Sv. Trojice a mali si postaviť nový kostol na západnom predmestí. Chrám potom opäť spravovali jezuiti, a to až do zrušenia rádu v r. 1773. V roku 1713 mal ich rád v Prešove 13 členov. Siedmi z nich boli kňazi, traja magistri a traja koadjutori. V r. 1773 museli odovzdať chrám i Kolégium. Od Juraja Mačalu, superiora a prešovského kňaza, oba objekty dňa 21.6.1773 prebrala trojčlenná komisia. Vtedy sa stali majetkom eráru. Chrám však dlhší čas nebol adekvátne využívaný.
V r. 1784 sa stal chrám majetkom evanjelickej cirkvi, ktorá ho kúpila od magistrátu za 6000 zlatých, a to spolu s Kolégiom. Používať sa začal až od novembra 1784, kedy bol definitívne odovzdaný evanjelikom. Kostol prevzal cirkevný dozorca evanjelickej cirkvi Žigmund Topercer. Využívali ho spoločne slovenský a nemecký (neskôr nemecko-maďarský) ev. zbor. Na konci 18. st. mali oba zbory 2606 členov, z toho slovenský 1553.
5. júla 1788 počas veľkého požiaru, ktorý zachvátil mesto, zhorela strecha i veža chrámu. Neskôr ich obnovili veriaci z vlastných prostriedkov.
Po vzniku Československa (1918) sa slovenskí evanjelici vyčlenili z organizačnej štruktúry celokrajinskej uhorskej evanjelickej cirkvi. Generálna cirkevná rada na Slovensku zriadila Východný a Západný dištrikt evanjelickej cirkvi augsburského vyznania. Prešovské evanjelické zbory boli súčasťou Východného dištriktu a v užšom organizačnom rámci súčasťou Šarišského seniorátu. V r. 1930-1945 sa Prešov stal biskupským sídlom Východného dištriktu, čím Chrám Sv. Trojice vzrástol na svojom význame. Prvým biskupom Východného dištriktu evanjelickej a.v. cirkvi po prenesení sídla do Prešova sa stal Vladimír P. Čobrda (1880-1969). Prešov sa stal nanovo sídlom biskupstva až za účinkovania Jána Midriaka (*1929) v roku 1994.
Zdroj: Sprievodca po sakrálnych pamiatkach a cirkevnom živote Prešova,
Universum Prešov, 1999, ISBN 80-967753-4-0